作者：伊岚，靳亚平，史薇，黄建文
摘要：奶牛乳房炎是一种多因素性疾病，尽管有很多研究报道，但许多问题并未得到解决，仍是造成奶业损失的主要疾病之一。隐性乳房炎检测方法的研究具有重要的临床意义，其方法包括乳中体细胞计数法、乳汁pH检验法、乳汁的细菌培养、电导率值检验法、酶类检测法、乳成分直接检测法、PCR检测方法和MTT法。
关键词：奶牛；乳房炎；检测方法
奶牛乳房炎广泛存在于世界各地，是奶牛的一种常见病。奶牛发病后可引起奶量和乳品质下降、治疗费用增加，严重者造成奶牛过早的淘汰，给奶业生产造成很大损失。Lund等()报道，美国每头奶牛平均每年因乳房炎造成的损失约为美元，加拿大为～美元，丹麦估计超过美元。我国奶牛乳房炎阳性率在46.4%～85.7%，乳区阳性率为28%～59%。
乳房炎对奶牛业危害极大，临床型乳房炎因症状明显，容易诊断；而隐性乳房炎需要借助特殊的检测方法方可作出诊断。隐性乳房炎发病率高，无明显的临床症状，乳汁的生物化学和乳汁成分虽有变化，但肉眼很难察觉；随着病情的发展，可能会变成临床型乳房炎。如能做到早发现早控制，可把损失减少到最小程度。因而，隐性乳房炎检测方法的研究就显得尤为重要。隐性乳房炎检测方法包括乳中体细胞计数法、乳汁pH检验法、电导率值检验法、酶类检测法、MTT法和乳成分直接检测法。
1乳中体细胞计数法
当奶牛发生乳房炎时，乳汁中的体细胞数目，特别是白细胞的数目显著增加。这是在乳腺感染后，微生物及其代谢产物诱导中性粒细胞和巨噬细胞进入乳腺的结果。同时，损伤脱落的上皮细胞也进入乳中，致使乳汁中的体细胞增加。因此，可以通过检测乳汁中体细胞的多少来判断奶牛是否患有隐性乳房炎。乳汁细胞学检查方法很多，可将其分为乳中体细胞直接计数法和间接计数法。
1.1乳中体细胞直接计数法
体细胞计数(somaticcellcounts，SCC)即每毫升乳汁中含有的体细胞数量。乳腺感染细菌后，由于中性粒细胞对细菌的生长和代谢产物有趋化性，结果导致中性粒细胞的渗出。进入乳腺的白细胞，通过分泌细胞间隙进入乳中。同时，受损脱落的上皮细胞也进入乳中，导致乳中体细胞数量增多。因此，根据乳汁中体细胞数含量的多少来判断是否患有隐性乳房炎是一种比较简便、可靠的方法，但此方法仪器设备及药品费用昂贵，不利于普及推广。
Little和Plastridge()直接用显微镜进行细胞计数(DMSCC)，认为每毫升乳汁中细胞数超过50万，可定为隐性乳房炎；也有人认为超过25万即可定为隐性乳房炎。目前，乳中的体细胞数可用专门的荧光显微自动测定仪来检测，如丹麦福斯公司出品的Fossomatic系列奶牛体细胞测定仪全自动计算机操作，每小时可检测样品～个，准确、快速的记数方法，使该项技术在世界范围内被推广应用。
中国农业科学院兰州兽医研究所根据试验提出在治疗乳房炎判定疗效时，以每毫升乳汁中细胞数降至万以下就可定为正常，国外也有类似的报道。白细胞分类计数的刻度管检验法，这是一种根据中性粒细胞占白细胞总数的多少来判定乳房炎的方法。中性粒细胞占白细胞总数的12%～20%定为可疑，20%以上则定为乳房炎。另外，国外已研制的体细胞自动计数仪，已在乳汁检测中得到应用。
1.2乳中体细胞间接计数法
CMT法是年Scalm和Noorlander首创的化学检验法，也称加利福尼亚隐性乳房炎检测法(CaliforniaMastitisTest)。在CMT试液的作用下，乳汁细胞中的脂类物质发生乳化，乳汁细胞被破坏，释放出的DNA发生沉淀或凝块，根据其量的多少来间接判定乳中细胞数的多少而达到诊断的目的。CMT操作简便，较适用于大规模奶牛场的检测。但每次加药量需要准确量取，判断时需要有一定的经验。
LMT是中国农科院兰州中兽医研究所根据CMT诊断原理，结合我国药源条件研制出来的，检验方法及效果与CMT基本一致。国内还有许多研究机构也根据相似原理研制出各种隐性乳房炎检验试剂，如BMT(北京奶牛研究所)、SMT(上海奶牛研究所)、HMT(黑龙江省兽医科学研究所)等，已达到了CMT试剂的国产化。日本的PL法也是由CMT法衍变而来的。
这些检验方法反应机理基本是一致的，主要成分为表面活性剂———烷基或烃基硫酸盐。即在它的作用下使乳中体细胞破裂，释放脱氧核糖核酸(DNA)，形成黏度很大的水溶液，其黏度与乳汁中细胞数成正相关，即乳中体细胞越多溶液黏度越大。
潘军等()利用十二烷基磺酸钠加指示剂制成改进CMT试液，使凝聚反应易于判定，同时可检出酸度高的乳汁来。欧阳五庆等()在对现有各种诊断方法比较的基础上，采用不同新合成的国产表面活性剂组成多种配方进行筛选，选出了SMT-Ⅰ、SMT-Ⅱ、SMT-Ⅲ3种隐性乳房炎诊断液。
试验结果表明SMT系列诊断液反应敏感，尤其是SMT-Ⅰ试液，只需5s即可显示结果。过氧化氢酶法是通过检测乳中白细胞的过氧化氢酶来推断白细胞含量的一种方法。
2乳汁的细菌培养
培养乳汁进行微生物鉴定是检查乳房炎的标准方法。利用桶奶乳汁微生物鉴定，若发现无乳链球菌、金黄色葡萄球菌或霉形体，就有可能引起该牛群乳房炎的暴发。但进行微生物学培养不但工作量大，而且存在许多局限性，如患有隐性乳房炎的乳汁中体细胞数高，影响细菌的生长，易产生假阴性结果。
3乳汁pH检验法
3.1麝香草酚兰检验法(BTB法)
乳房炎发生时，乳汁中的pH上升，通过测定乳汁pH便可以达到判定目的。在检验pH的方法中，操作比较简单而且常用的是BTB法。BTB法有2种操作方法即试管法和玻片法。
3.2试纸法
自Joshis等报道用奶牛乳房炎试纸进行隐性乳房炎现场诊断以后，现在这一方法已在美、德、法等多个国家作为检测和控制隐性乳房炎的主要措施，受到牛场主的很大重视。在国内，王林安等在年研制出奶牛乳房炎试纸并在我国养牛业中应用。日本早已研制出用BPB滤纸片诊断乳房炎的方法。这种方法需要把乳汁中的乳清分离出来作为检查病样。张蔓茹等对BPB法进行改进，探讨了全乳加醋酸和全乳不加醋酸处理的BPB滤纸片快速诊断法，结果表明，全乳BPB诊断法的准确性可靠而且灵敏性较高。
4电导率值检验法
从20世纪40年代开始，人们就开始研究利用隐性乳房炎乳汁的导电性增强的原理来检测隐性乳房炎，但直到20世纪80年代才开始走向实用化。电导率检测法的技术依据是牛血浆与牛乳的渗透压相等，健康奶牛乳汁渗透压大约75%由氯化钠和乳糖形成。
当奶牛患乳房炎后，乳腺上皮组织细胞制造乳糖能力下降，乳汁渗透压就低于血浆渗透压，形成了血管壁与乳腺细胞之间渗透压差，通过这一压差，提高了血液成分渗入乳汁的能力，特别使乳汁中氯化钠含量增加。乳糖是不导电的，氯化钠是导电的，氯化钠的增加使乳汁的电导率上升。
根据上述原理，日本首先研制出便携式袖珍电子诊断仪，国内已使用的有山西农大SX-1型乳房炎诊断仪，CN乳房炎诊断仪等。目前，利用电导率仪直接诊断奶牛隐性乳房炎技术还没有得到推广，其原因是仪器的温度补偿系数与牛奶温度升降后的电导率变化系数不一致，测定结果不准确。但是电导率仪是各行业普遍使用的仪器，而且价格低廉。
为了充分发挥其优势，通过对隐性乳房炎奶牛乳汁不同温度电导率测定研究，制定出电导率法判定奶牛隐性乳房炎标准，弥补了该仪器的不足。近年来的一些研究表明，牛群的种类、年龄、奶样的脂含量、温度和采样时间均对电导率的检测结果有影响，其中采样时间影响最大，清晨是奶样评估的最佳时间。
5年Fullwood已经通过一种新型的电导率检测系统4QC，该系统灵敏度很高，92%%的奶牛乳房炎能被检测出，精确度和特异性为95%～98%。较2年灵敏度50%、特异性87%的IAH有很大的提高。电导率仪检测奶牛乳房炎，只需一次性投资，无须任何试剂和其他辅助技术，快速，简便，适用于小型奶牛场。
5酶类检测法
自Ishikawa和Kitchen()研究证实，乳酸脱氢酶(LDH)主要来自被损害的上皮细胞和大量的乳汁白细胞，LDH活性增加反映了白细胞大量聚集的炎症过程和乳腺组织的损害程度。近10年来，经先后对二十几种酶及生化物质进行分析研究，发现乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、谷氨酸草酰乙酸转氨酶和血清蛋白与乳体细胞数呈很强的正相关，尤其以乳酸脱氢酶的相关性最强(r2=0.)，乳腺和牛乳中含有乳酸脱氢酶同工酶5种：LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。
正常乳腺组织和牛乳中LDH1活性很高，LDH3活性很低。患有乳房炎的奶牛在乳腺及其分泌乳中LDH5活性升高，LDH1活性降低。因此认为患有乳腺炎时，乳中LDH1降低，LDH2、LDH3、LDH4、LDH5活性升高，这几种酶可作为牛乳腺炎一项辅助诊断指标。在乳中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)来自于白细胞和乳腺组织。正常乳中，白细胞释放的NAGase只占10%～20%，乳腺组织的NAGase占大部分。奶牛患有乳腺炎时，由于病原菌对乳腺组织破坏，使NAGase释放。
另外，奶牛患有炎症时白细胞释放的NAGase也增加，乳中NAGase活性显著增加。因此，检验乳中的NAGase即可检测出乳房炎乳。Middleton对华盛顿州和俄勒冈州等8个奶牛群(共头)进行了研究，结果表明乳腺受金黄色葡萄球菌感染时，其NA-Gase含量增加，其中受感染组与对照组NAGase的含量分别为15.3和4.7，差异显著。
因此，检测NAGase的含量即可判断乳腺是否受到细菌污染。酶类检测法是一种近几年来新兴的检测方法，该方法可以判断奶牛所产乳是否为乳房炎乳，方法准确、可靠。但酶类检测法需要专门的检测仪器，且仪器造价高。
6乳成分直接检测法
国外常根据乳的成分——脂肪、蛋白质、乳糖、柠檬酸盐、体细胞数等来综合评价乳的质量及牛的健康状况。乳成分的变化与患乳房炎的严重程度密切相关，对这些指标的综合分析，不但可以提高对隐性乳房炎的预测能力，还可以预测奶牛患病的程度。但是这些指标会受到饲料、泌乳阶段、季节的影响，应该综合考虑。
Sloth等通过丹麦FossElectric公司CombiFoss分析仪直接检测了牛乳成分变化量，并且通过多元分析方法评价各参数与牛健康程度的相关性。MottramtgT生物传感器对乳中尿素、酮类、脂肪、离子浓度、酶等进行在线检测。检测可以达到在样品消耗量最少的情况下，及时、准确、全面地评价乳的营养状况、牛体的健康状态，预防乳房炎乳的产生。Kauf研究表明患乳房炎的乳中，β-酪蛋白含量降低了41%。
试验结果表明β-酪蛋白的含量可以作为检测乳房炎乳的指标，这可以在奶牛乳房炎乳检测中作为参考。Tsenkova等(1)选择1～2nm通过近红外分光光度计，测定了7头荷斯坦奶牛的个样品，检测项目主要包括脂肪、乳糖、蛋白质、离子浓度和体细胞数等。结果表明，体细胞增加后乳中蛋白质和离子浓度是影响吸光值主要因素，通过检测蛋白质和离子浓度即可分析奶牛产乳是否为乳房炎乳。宋宣明等在年设计出用牛乳清电泳的变化来诊断隐性乳房炎的方法。这种方法较为直观、准确。
国外近年来一些研究表明，奶牛患乳房炎时，其血液或奶中一些细胞因子或急性期蛋白(如血清淀粉样A蛋白和结合珠蛋白)变化明显。陈国灿等依据自然发生的奶牛隐性乳房炎病例，对奶中血清淀粉样A蛋白和结合珠蛋白的检测，研究表明，奶牛患有隐性乳房炎时，于肝脏内合成的急性期蛋白诸如血清淀粉样A蛋白和结合珠蛋白的量增加。进而为实际奶牛生产中有效预防和治疗乳房炎提供更为可靠的理论依据，也成为判定奶牛隐性乳房炎发生与否的判定标准。
对奶牛奶中血清淀粉样A蛋白和结合珠蛋白的同时检测，再加上奶中体细胞数的测定，这些更有助于对隐性乳房炎的准确判定。随着现代化奶牛场规模的不断扩大，及自动挤奶系统的投入使用，也迫切需要这种适用于一体化操作的新型检测方法。
7PCR检测方法
Phuektes等建立了一种以16S～23SrDNA间隔区为扩增靶序列的多重PCR检测方法，是一种崭新的分子水平细菌分类和鉴定方法。该方法能快速对乳房炎病原菌进行鉴定，且对种特异性16S～23SrDNA间隔区序列进行扩增具有高敏感性和特异性，即使奶牛乳汁中仅含有少量病原菌也能被检测出来，因而已在医学和兽医学临床诊断中得到了比较广泛的应用。
Riffon等也以16S～23SrDNA间隔区为扩增靶序列建立了多重PCR检测方法，试验表明该方法是一种快速敏感和特异的乳房炎诊断方法。Gillespie等报道，多重实时PCR检测方法有望直接从乳汁中对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌进行同步鉴定。
8MTT检测法
目前，MTT法已经广泛应用于细胞增殖的测定，也应用于肿瘤药物敏感性试验研究。许多细菌如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、李氏杆菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌等都能将MTT转化为甲臜。因此，MTT法也适用于检测这些细菌等。奶牛乳房炎主要是由病原菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠埃希菌等引起的。
因此，MTT法用于检测奶牛乳房炎是较为直接、准确的方法。伊岚等建立的MTT法检测乳房炎方法，作用原理是黄色的MTT能被活细菌细胞内线粒体膜上的脱氢酶(如琥珀酸脱氢酶)还原成蓝紫色的不溶性的甲臜类物质，甲臜产生的量与活细菌细胞数在一定范围内呈线性关系，通过观察其颜色深浅或测定其OD值，检测存活的细菌数。MTT法用于检测奶牛乳房炎，具有快速、灵敏、简便、准确等优点，不需特殊设备，经不断改进、完善，必将会得到更为广泛的应用。
9结语
总之，由于奶牛乳房炎给奶牛养殖业造成严重的危害，通过实验室检测方法对奶牛隐性乳房炎进行确诊以及监测是防控该病的重要环节。在临床应用过程中，必须充分考虑每种诊断方法的优点及局限性，综合检测结果及其流行病学资料和疫苗应用情况，才能了解奶牛乳房炎实际流行状况，从而采取针对性措施。
责任编辑：小镖
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